Desktop-Gigapixel-Mikroskop - Gunook

2024 Autor: John Day | [email protected]. Zuletzt bearbeitet: 2024-01-30 07:19

Bei optischen Mikroskopen gibt es einen grundlegenden Kompromiss zwischen Sichtfeld und Auflösung: Je feiner das Detail, desto kleiner der vom Mikroskop abgebildete Bereich. Eine Möglichkeit, diese Einschränkung zu überwinden, besteht darin, die Probe zu verschieben und Bilder über ein größeres Sichtfeld zu erfassen. Die Grundidee besteht darin, viele hochauflösende Bilder zu einem großen Sichtfeld zusammenzufügen. In diesen Bildern sehen Sie sowohl die vollständige Probe als auch feine Details in jedem Teil der Probe. Das Ergebnis ist ein Bild mit etwa einer Milliarde Pixeln, viel größer im Vergleich zu den Bildern einer DSLR oder eines Smartphones, die typischerweise etwa 10 bis 50 Millionen Pixel aufweisen. Schauen Sie sich diese Gigapixel-Landschaften an, um die enorme Menge an Informationen in diesen Bildern eindrucksvoll zu demonstrieren.

In diesem anweisbaren werde ich darüber sprechen, wie man ein Mikroskop baut, das ein 90 mm x 60 mm großes Sichtfeld mit Pixeln entsprechend 2 μm an der Probe abbilden kann (obwohl ich denke, dass die Auflösung wahrscheinlich näher an 15 μm liegt). Das System verwendet Kameraobjektive, aber das gleiche Konzept kann mit Mikroskopobjektiven angewendet werden, um eine noch feinere Auflösung zu erzielen.

Die mit dem Mikroskop aufgenommenen Gigapixel-Bilder habe ich auf EasyZoom hochgeladen:

1970 National Geographic Magazin Bild

Gehäkelte Tischdecke, die meine Frau gemacht hat

Sonstige Elektronik

Andere Ressourcen:

Tutorials zur optischen Mikroskopie:

Optische Auflösung:

Zusätzlich zum Bild-Stitching machen die jüngsten Fortschritte in der Computer-Bildgebung Gigapixel-Mikroskopie möglich, ohne die Probe auch nur zu bewegen!

Schritt 1: Lieferliste

Materialien:

1. Nikon DSLR (ich habe meine Nikon D5000)

2. Objektiv mit 28 mm Brennweite und 52 mm Gewinde

3. Objektiv mit 80 mm Brennweite und 58 mm Gewinde

4. 52mm bis 58mm Reverse-Kupplung

5. Stativ

6. Sieben Platten aus 3 mm dickem Sperrholz

7. Arduino Nano

8. Zwei H-Brücken L9110

9. Zwei IR-Strahler

10. Zwei IR-Empfänger

11. Taste drücken

12. Zwei 2,2 kOhm Widerstände

13. Zwei 150Ohm Widerstände

14. Ein 1kOhm Widerstand

15. Fernauslöser für Nikon-Kamera

16. Schwarze Postertafel

17. Hardware-Kit:

18. Zwei Schrittmotoren (ich habe Nema 17 Bipolar Schrittmotor 3.5V 1A verwendet)

19. Zwei 2mm Leitspindeln

20. Vier Kissenblöcke

21. Zwei Gewindemuttern

22. Zweilager-Gleitbuchse und 200-mm-Linearwellen:

23. 5V Netzteil:

24. Wire-Wrap-Draht

Werkzeuge:

1. Laserschneider

2. 3D-Drucker

3. Inbusschlüssel

4. Drahtschneider

5. Wire-Wrap-Tool

Schritt 2: Systemübersicht

Zur Translation der Probe bewegen zwei orthogonal ausgerichtete Schrittmotoren einen Tisch in x- und y-Richtung. Die Motoren werden über zwei H-Brücken und einen Arduino angesteuert. Ein IR-Sensor, der an der Basis des Schrittmotors positioniert ist, wird verwendet, um die Stufen zu nullen, damit sie nicht in eines der Enden der Blöcke laufen. Über dem XY-Tisch ist ein digitales Mikroskop positioniert.

Sobald die Probe positioniert und der Tisch zentriert ist, drücken Sie eine Taste, um mit der Erfassung zu beginnen. Die Motoren bewegen die Bühne in die untere linke Ecke und die Kamera wird ausgelöst. Die Motoren verschieben die Probe dann in kleinen Schritten, da die Kamera an jeder Position ein Foto aufnimmt.

Nachdem alle Bilder aufgenommen wurden, werden die Bilder dann zu einem Gigapixel-Bild zusammengefügt.

Schritt 3: Mikroskopmontage

Ich habe ein Mikroskop mit geringer Vergrößerung mit einer DSLR (Nikon 5000), einem Nikon 28mm f/2.8 Objektiv und einem Nikon 28-80mm Zoomobjektiv gebaut. Das Zoomobjektiv wurde auf eine Brennweite von 80 mm eingestellt. Der Satz der beiden Linsen wirkt wie eine Mikroskoptubuslinse und ein Objektiv. Die Gesamtvergrößerung ist das Verhältnis der Brennweiten, etwa 3X. Diese Objektive sind wirklich nicht für diese Konfiguration ausgelegt. Damit sich das Licht wie bei einem Mikroskop ausbreitet, müssen Sie eine Aperturblende zwischen den beiden Objektiven positionieren.

Montieren Sie zuerst das Objektiv mit längerer Brennweite an der Kamera. Schneiden Sie einen Kreis aus schwarzem Posterkarton mit einem Durchmesser von ungefähr der Größe der Vorderseite des Objektivs. Dann in der Mitte einen kleinen Kreis ausschneiden (ich habe ca. 3mm Durchmesser gewählt). Die Größe des Kreises bestimmt die Lichtmenge, die in das System eindringt, auch numerische Apertur (NA) genannt. Die NA bestimmt die laterale Auflösung des Systems für gut konstruierte Mikroskope. Warum also nicht eine hohe NA für dieses Setup verwenden? Nun, es gibt zwei Hauptgründe. Erstens treten mit zunehmender NA die optischen Aberrationen des Systems stärker hervor und begrenzen die Auflösung des Systems. In einem unkonventionellen Setup wie diesem wird dies wahrscheinlich der Fall sein, sodass eine Erhöhung der NA letztendlich nicht mehr zur Verbesserung der Auflösung beiträgt. Zweitens hängt die Schärfentiefe auch von der NA ab. Je höher die NA, desto geringer die Schärfentiefe. Dies macht es schwierig, Objekte, die nicht ganz flach sind, scharf zu stellen. Wenn die NA zu hoch wird, sind Sie auf die Abbildung von Objektträgern mit dünnen Proben beschränkt.

Die Positionierung der Blende zwischen den beiden Objektiven macht das System in etwa telezentrisch. Das heißt, die Vergrößerung des Systems ist unabhängig von der Objektentfernung. Dies wird wichtig für das Zusammenfügen von Bildern. Wenn das Objekt eine unterschiedliche Tiefe hat, hat die Ansicht aus zwei verschiedenen Positionen die Perspektive verschoben (wie beim menschlichen Sehen). Das Zusammenfügen von Bildern, die nicht von einem telezentrischen Bildgebungssystem stammen, ist eine Herausforderung, insbesondere bei einer so hohen Vergrößerung.

Verwenden Sie den 58- bis 52-mm-Objektivumkehrkoppler, um das 28-mm-Objektiv mit der Blende in der Mitte am 80-mm-Objektiv zu befestigen.

Schritt 4: XY-Bühnendesign

Ich habe die Bühne mit Fusion 360 entworfen. Für jede Scanrichtung gibt es vier Teile, die in 3D gedruckt werden müssen: Montagehalterung, zwei Verlängerungen für die Schlitteneinheit und eine Leitspindelhalterung. Die Basis und Plattformen der XY-Bühne sind aus 3 mm dickem Sperrholz lasergeschnitten. Die Basis hält den Motor und die Schieber in X-Richtung, die X-Plattform hält den Motor und die Schieber in Y-Richtung und die Y-Plattform hält die Probe. Die Basis besteht aus 3 Blechen und die beiden Plattformen bestehen aus 2 Blechen. In diesem Schritt werden die Dateien für das Laserschneiden und den 3D-Druck bereitgestellt. Nach dem Schneiden und Drucken dieser Teile sind Sie bereit für die nächsten Schritte.

Schritt 5: Montage der Motorhalterung

Wickeln Sie mit einem Drahtwickelwerkzeug Draht um die Leitungen von zwei IR-Sendern und zwei IR-Empfängern. Kodieren Sie die Drähte farblich, damit Sie wissen, welches Ende welches ist. Dann schneiden Sie die Leitungen von den Dioden ab, so dass nur noch die Wire-Wrap-Drähte ablaufen. Schieben Sie die Drähte durch die Führungen in der Motorhalterung und drücken Sie dann die Dioden in Position. Die Kabel sind so ausgerichtet, dass sie erst sichtbar sind, wenn sie an der Rückseite des Geräts austreten. Diese Drähte können mit den Motorkabeln verbunden werden. Montieren Sie nun den Schrittmotor mit vier M3-Schrauben. Wiederholen Sie diesen Schritt für den zweiten Motor.

Schritt 6: Bühnenmontage

Kleben Sie die Zuschnitte Base 1 und Base 2 zusammen, einer davon mit Sechskantöffnungen für die M3-Muttern. Sobald der Kleber getrocknet ist, hämmern Sie die M3-Muttern in Position. Die Muttern drehen sich nicht, wenn sie in die Platine gedrückt werden, sodass Sie die Schrauben später einschrauben können. Kleben Sie nun das dritte Basisblech (Base 3), um die Muttern zu bedecken.

Jetzt ist es an der Zeit, die Bleimutterhalterung zu montieren. Entfernen Sie alle zusätzlichen Filamente aus der Halterung und drücken Sie dann vier M3-Muttern in Position. Sie sitzen fest, also stellen Sie sicher, dass Sie den Bolzen- und Mutternraum mit einem kleinen Schraubendreher entfernen. Sobald die Muttern ausgerichtet sind, drücken Sie die Führungsmutter in die Halterung und befestigen Sie sie mit 4 M3-Schrauben.

Bringen Sie die Stehlager, Gleiterhalterungen und Motorhalterung für den Linearübersetzer in X-Richtung an der Basis an. Setzen Sie die Leitspindelbaugruppe auf die Leitspindel und schieben Sie dann die Leitspindel in Position. Verwenden Sie den Koppler, um den Motor mit der Leitspindel zu verbinden. Setzen Sie die Schiebereinheiten in die Stangen ein und schieben Sie die Stangen dann in die Schieberhalterungen. Schließlich befestigen Sie die Slider-Mount-Extender mit M3-Schrauben.

Die Sperrholzplatten X1 und X2 werden auf ähnliche Weise wie die Basis verklebt. Das gleiche Verfahren wird für den Linearübersetzer in Y-Richtung und den Probentisch wiederholt.

Schritt 7: Scannerelektronik

Jeder Schrittmotor hat vier Kabel, die mit einem H-Brückenmodul verbunden sind. Die vier Kabel vom IR-Sender und -Empfänger werden gemäß obigem Diagramm an die Widerstände angeschlossen. Die Ausgänge der Empfänger sind mit den Analogeingängen A0 und A1 verbunden. Die beiden H-Brücken-Module sind mit Pin 4-11 des Arduino Nano verbunden. An Pin 2 ist ein Taster mit einem 1kOhm-Widerstand für einfache Benutzereingaben angeschlossen.

Schließlich wird der Auslöser für die dSLR wie bei meinem CT-Scanner mit einem Fernauslöser verbunden (siehe Schritt 7). Schneiden Sie das Kabel des Fernauslösers ab. Die Drähte sind wie folgt gekennzeichnet:

Gelb – Fokus

Rot – Verschluss

Weiß – gemahlen

Um die Aufnahme zu fokussieren, muss das gelbe Kabel mit Masse verbunden werden. Um ein Foto aufzunehmen, müssen sowohl der gelbe als auch der rote Draht mit Masse verbunden sein. Ich habe eine Diode und das rote Kabel an Pin 12 angeschlossen, und dann habe ich eine andere Diode und das gelbe Kabel an Pin 13 angeschlossen. Das Setup ist wie in DIY Hacks and How-Tos beschrieben.

Schritt 8: Erfassen von Gigapixel-Bildern

Anbei der Code für das Gigapixel-Mikroskop. Ich habe die Stepper-Bibliothek zur Steuerung der Motoren mit der H-Brücke verwendet. Am Anfang des Codes müssen Sie das Sichtfeld des Mikroskops und die Anzahl der Bilder angeben, die Sie in jede Richtung aufnehmen möchten.

Zum Beispiel hatte das von mir hergestellte Mikroskop ein Sichtfeld von etwa 8,2 mm x 5,5 mm. Daher habe ich die Motoren angewiesen, 8 mm in x-Richtung und 5 mm in y-Richtung zu verschieben. In jede Richtung werden 11 Bilder aufgenommen, insgesamt 121 Bilder für das vollständige Gigapixel-Bild (mehr dazu in Schritt 11). Der Code berechnet dann die Anzahl der Schritte, die die Motoren machen müssen, um die Bühne um diesen Betrag zu verschieben.

Woher wissen die Stufen, wo sie sich relativ zum Motor befinden? Wie werden die Stufen übersetzt, ohne an einem Ende zu treffen? Im Setup-Code habe ich eine Funktion geschrieben, die die Bühne in jede Richtung bewegt, bis sie den Weg zwischen IR-Sender und IR-Empfänger unterbricht. Wenn das Signal am IR-Empfänger unter einen bestimmten Schwellenwert fällt, stoppt der Motor. Der Code verfolgt dann die Position der Bühne relativ zu dieser Ausgangsposition. Der Code ist so geschrieben, dass der Motor nicht zu weit übersetzt, was dazu führen würde, dass die Bühne in das andere Ende der Leitspindel läuft.

Sobald der Tisch in jede Richtung kalibriert ist, wird der Tisch in die Mitte verschoben. Mit einem Stativ positionierte ich mein dSLR-Mikroskop über dem Tisch. Es ist wichtig, das Kamerafeld mit den gekreuzten Linien auf dem Probentisch auszurichten. Sobald die Bühne mit der Kamera ausgerichtet ist, habe ich die Bühne mit einem Malerband abgeklebt und dann die Probe auf die Bühne gelegt. Der Fokus wurde mit der Stativ-Z-Richtung eingestellt. Der Benutzer drückt dann die Drucktaste, um mit der Erfassung zu beginnen. Die Bühne wird in die untere linke Ecke übersetzt und die Kamera wird ausgelöst. Der Objekttisch scannt dann die Probe, während die Kamera an jeder Position ein Foto aufnimmt.

Ebenfalls beigefügt ist ein Code zur Fehlerbehebung bei den Motoren und IR-Sensoren.

Schritt 9: Bilder zusammenfügen

Bei all den aufgenommenen Bildern stehen Sie nun vor der Herausforderung, sie alle zusammenzufügen. Eine Möglichkeit, die Bildzusammenfügung zu handhaben, besteht darin, alle Bilder in einem Grafikprogramm manuell auszurichten (ich habe Autodesk's Graphic verwendet). Das wird definitiv funktionieren, aber es kann ein schmerzhafter Prozess sein und die Ränder der Bilder sind in den Gigapixel-Bildern erkennbar.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, Bildverarbeitungstechniken zu verwenden, um die Bilder automatisch zusammenzufügen. Die Idee besteht darin, ähnliche Merkmale im überlappenden Abschnitt benachbarter Bilder zu finden und dann eine Translationstransformation auf das Bild anzuwenden, damit die Bilder aneinander ausgerichtet sind. Schließlich können die Kanten durch Multiplizieren des überlappenden Abschnitts mit einem linearen Gewichtungsfaktor und Addieren der Kanten miteinander vermischt werden. Dies kann ein entmutigender Algorithmus sein, wenn Sie neu in der Bildverarbeitung sind. Ich habe eine Weile an dem Problem gearbeitet, aber ich konnte kein vollständig zuverlässiges Ergebnis erzielen. Der Algorithmus hatte am meisten Probleme mit Samples, die durchweg sehr ähnliche Merkmale aufwiesen, wie etwa die Punkte im Magazinbild. Anbei ist der Code, den ich in Matlab geschrieben habe, aber es braucht etwas Arbeit.

Die letzte Option ist die Verwendung von Gigapixel-Foto-Stitching-Programmen. Ich habe keine vorzuschlagen, aber ich weiß, dass sie da draußen sind.

Schritt 10: Mikroskopleistung

Falls Sie es verpasst haben, hier sind die Ergebnisse: Zeitschriftenbild, gehäkelte Tischdecke und verschiedene Elektronik.

Die technischen Daten des Systems sind in der obigen Tabelle aufgeführt. Ich habe es mit einem Objektiv mit 28 mm und 50 mm Brennweite versucht. Die bestmögliche Auflösung des Systems habe ich anhand der Beugungsgrenze (ca. 6μm) abgeschätzt. Es ist tatsächlich schwierig, dies ohne ein hochauflösendes Target experimentell zu testen. Ich habe versucht, eine Vektordatei zu drucken, die in diesem Forum für Großformatfotografie aufgeführt ist, aber ich war durch meine Druckerauflösung eingeschränkt. Das Beste, was ich mit diesem Ausdruck feststellen konnte, war, dass das System eine Auflösung <40μm hatte. Ich suchte auch nach kleinen, isolierten Merkmalen auf den Proben. Das kleinste Merkmal im Druck aus dem Magazin ist der Tintenfleck, den ich ebenfalls auf etwa 40μm schätzte, sodass ich ihn nicht verwenden konnte, um eine bessere Schätzung für die Auflösung zu erhalten. Es gab kleine Divots in der Elektronik, die ziemlich gut isoliert waren. Da ich das Sichtfeld kannte, konnte ich die Anzahl der Pixel zählen, die den kleinen Divot einnehmen, um eine Schätzung der Auflösung zu erhalten, etwa 10-15 μm.

Insgesamt war ich mit der Leistung des Systems zufrieden, aber ich habe ein paar Anmerkungen, falls Sie dieses Projekt ausprobieren möchten.

Stabilität der Bühne: Besorgen Sie sich zunächst hochwertige Lineartischkomponenten. Die von mir verwendeten Komponenten hatten viel mehr Spiel als ich dachte. Ich habe für jede Rute nur eine der Slider-Halterungen im Kit verwendet, vielleicht fühlte sich die Bühne deshalb nicht sehr stabil an. Die Bühne funktionierte für mich gut genug, aber das würde bei Systemen mit höherer Vergrößerung zu einem größeren Problem werden.

Optik für höhere Auflösung: Die gleiche Idee kann für Mikroskope mit höherer Vergrößerung verwendet werden. Allerdings werden kleinere Motoren mit feinerer Schrittweite benötigt. Beispielsweise würde eine 20-fache Vergrößerung mit dieser dSLR zu einem Sichtfeld von 1 mm führen (wenn das Mikroskop ein so großes System ohne Vignettierung abbilden kann). Electronupdate verwendete Schrittmotoren von einem CD-Player in einem schönen Aufbau für ein Mikroskop mit höherer Vergrößerung. Ein weiterer Kompromiss ist die geringe Schärfentiefe, was bedeutet, dass die Bildgebung auf dünne Proben beschränkt ist und Sie einen feineren Translationsmechanismus in z-Richtung benötigen.

Stabilität des Stativs: Dieses System würde mit einer stabileren Kamerahalterung besser funktionieren. Das Linsensystem ist schwer und das Stativ ist um 90 Grad aus der vorgesehenen Position geneigt. Ich musste die Füße des Stativs abkleben, um die Stabilität zu verbessern. Der Verschluss könnte die Kamera auch so stark verwackeln, dass die Bilder unscharf sind.